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温度和pH对捕食性线虫分离株

2015-6-24 12:14:10      点击:
    50多年来,几乎完全依赖驱虫药控制家畜胃肠道线虫,但随着驱虫药的不断使用,随之而来的是线虫对驱虫药的抗药性不断地增强,而且其流行有越来越严重之趋势[‘〕。驱虫药的使用会造成环境污染、畜产品中化学药物的残留以及破坏生态平衡,这些问题也已受到科学家的倍加关注[2〕。因此,目前正在探讨和培育抗寄生虫家畜品种、使用草场管理系统、开发线虫疫苗、寻找对寄生虫能够天然防治的含有浓缩丹宁的植物以及利用食线虫性真菌的生物防治策略[i.s},其中利用食线虫性真菌的生物防治是这些防治策略中技术难度小、比较直接有效而且是最有前景的方法之一[s}目前为止,已发现200多种真菌可以利用其特殊的结构杀死自由生活线虫[s}。在家畜寄生虫研究领域中,利用捕食线虫性真菌作为一种新的防治寄生线虫手段在国外已开展了深人的研究,迄今用于动物寄生线虫防治的捕食线虫性真菌中研究最多的有3个属川:达丁屯氏属(Duddinn to-nia),如鞭式达丁屯氏菌(D.flagrans);节丛抱属(llrthrobotrys)、如少抱节丛抱菌(l1.  oligos-po二)、弯抱节丛抱菌(l1.  musi f ormis) } }}0n}锥节丛抱菌(l1.  conoides),叶状枝节丛抱菌(}1.  clad-odes)、卵形节丛抱菌(l1.   ovi f ormis)、强力节丛抱菌(l1.  robu sta );单顶抱属(M。二‘}rosporium),如奇妙单顶抱菌(M.   thaumasium)、中华单顶抱菌(M.  sinense)、附妊抱单顶抱菌(M.  appendic-ulatum)。
    目前,关于捕食线虫性真菌隔指抱属(D。‘、-tylella )用于动物寄生线虫生物防治的研究很少。长抱隔指抱菌(Dactylella Leptosp。二)在中国北京、贵州、石南、湖北等地有分布[C s7,但国内大部分地区的分布情况不清,而且已经分离的这些菌株都是从草地或林地的土壤中分离得到的。虽然国内对该种真菌的分离、地理分布和形态学做了一些研究工作,但由于各个地区的地理环境、气温不同,该种真菌的生物学特性亦存在差异。掌握不同分离株的生存环境及所需条件至关重要,研究影响不同地理株长抱隔指抱菌生长的各种因索,对于该捕食线虫性真菌可能作为动物寄生性线虫生物控制的候选菌株亦是十分必要的。由于长抱隔指抱菌生长J漫、寄生能力强,该真菌生长所需条件如营养、温度、pH等研究未见报道。因此,本研究利用从内蒙古集宁地区绵羊粪便中分离得到的菌株,探讨分离株的生长特性及pH和温度对其生长的影响,以便为今后利用这种捕食性真菌开展动物寄生线虫病的生物防治提供科学依据。
1材料与方法
1. 1菌种
    捕食线虫性真菌一长抱隔指抱菌(Dactylel-la leptospora ),分离株编号为IS-0307,系2013年8月从采集于内蒙古集宁地区绵羊新鲜粪便中分离纯化获得,菌株于二=2%的玉米粉琼脂斜面培养基4 `C保存。
1. 2培养基
    0. 6  g/I、不同pH玉米粉琼脂培养基(CMA):称取新鲜玉米粉60 g,加人1 000 mI.蒸馏水中,混匀后微火煮沸1h,补足水量至 1 000mL; 6层纱布过滤,滤液4 `C沉淀过夜,虹吸上清液,然后取滤液10 mI.,加到990 mI.蒸馏水中,混匀。根据分组情况不同分别调pH为4,5,6,7,8,9,10,11,12,最后加人琼脂粉使其琼脂质量分数为200,经121 `C ,20 min高压灭菌后,倾注于直径为9 cm的培养皿内备用。另外,0. 4 g/I_常规CMA和0. 6 g/I. CMA培养基制作方法除不调pH外,基本同上。
    马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA ):按常规方法制备和灭菌,倾注于直径为9 cm的培养皿内备用。
1. 3线虫
    N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis el-mans , the Bristol strain N2)和()P50尿嚓陡渗漏突变型大肠杆菌,均由中国科学院铸州兽医研究所李有全博士惠赠。按照李有全等[7〕方法培养秀丽隐杆线虫,用M9缓冲液冲下虫体。临用时再用灭菌蒸馏水1 000r/min}5 min离心清洗虫体,重复3次,在光学显微镜下检查虫体的活力并记数,按要求用灭菌蒸馏水配成一定浓度的虫体悬液。
1. 4温度对长抱隔指抱菌生长影响的测定
    将保存在玉米粉斜面培养基的菌株,从试管中转接于0. 4 g/I. CMA平皿上,2 0 `C培养7d后,切取4 mm X 4 mm大小的含有真菌的琼脂块,接种于0. 4 g/I. CMA平板中于2 5 `C培养7d,然后用直径为5 mm的打孔器取出同等大小的含有真菌的琼脂块接种于同一批制作的0. 6 g/I. CMA平板中央,分4组,每组为3个培养皿。将接种后的培养皿分别于15 `C}20 `C}25 `C}30℃下培养,每天定时观察真菌的生长情况,从接种后第4天(约接种后72 h),记为接种后3d开始测定其生长速度,此后分别于4,5,6,8,12,13,16,17,20 d定时测量1次,共计10次;生长速度测定采用游标卡尺从平皿的背面十字交叉法量其菌落的直径,记录和计算每个平皿中菌落生长的平均直径,最后统计各组中测量当天的菌落平均直径并计算出生长速度。日平均生长速度(mm/d)一(各组中测量当天的菌落直径平均值一5)/时间,公式中的5为所接种琼脂块的直径。将统计的数据输人Excel中作图。
1. 5   pH对长抱隔指抱菌生长影响的测定
    分离株培养和接种方法同“1. 4",不同的是分别接种pH为4,5,6,7,8,9,10,11,12的0. 6 g/I.CMA。每一pH接种3个培养皿,试验先后重复2次。将上述接种后的平皿置2 5 `C温箱中培养,每天定时观察真菌的生长情况,从接种后第3 d(约接种后48 h),记为接种后2d开始测定其生长速度,此后分别于4,6,8,10,12,14,16,18,20d每隔1d测量1次,共计10次;日平均生长速度(mm/d)的测定、数据处理和作图同“1. 4" o
1. 6生物学特性观察
    取分离株长抱隔指抱菌纯培养物,切取含有真菌组织的琼脂块转接于0. 4 g/I. CMA和PDA平板,每天用肉眼和倒置显微镜(OLYMPUS,IX2-SLP,日本)观察其生长发育情况,用光学显微镜(OLYMPUS, CX21,日本)度量抱子等的形态大小(n=50)。特殊结构用乳酸酚棉蓝染色液制片观察,并拍照记录。对于捕食结构的诱导和捕食现象的观察,是将分离株按照上述方法接种于0. 4 g/I. CMA平板上,待菌妊生长达到培养皿的1/2或铺满培养皿2/3时,将清洁后的秀丽隐杆线虫悬液200 pI.(含约4 000条)加人培养皿中,12 h后观察真菌对线虫的捕食情况,记录拍照。培养过程中对培养物的菌落特征、分生抱子形态及大小、产抱方式、捕食器等进行拍照和测定。形态分类鉴定主要按照李天飞等[lj、张克勤等[几〕的描述进行(正文中括号内的数字为平均值,、为测量样本数)。
2结果与分析
2. 1不同温度对长抱隔指抱菌生长的观察
    不同温度对长抱隔指抱菌生长情况的影响见图1。从图1可知,长抱隔指抱菌在所设定的试验温度范围内(15 ^-3 0 `C)均能生长。相同的pH条件下,在20 d内观察,其温度按日均生长速度快慢依次排列为25 `C}20 `C}15 `C}30 `C,2 5 `C时生长最佳,3 0 `C时生长最差。在不同温度下,该菌初期生长较快,至13 d左右有一个相对大小峰值,此后菌妊生长速度逐渐减缓。
2. 2长抱隔指抱菌在不同pH培养基中生长的观察
    不同pH对长抱隔指抱菌生长情况的影响见图2。从图2可知,长抱隔指抱菌在所设定的试验pH(4^-12)范围内,均能不同程度地生长。在2 5 `C下,其pH按日均生长速度快慢依次排列为pH 11>pH 10>pH 12>pH 9>pH 8>pH 7>pH 6>pH 5>pH 4,在20 d内观察,除pH 6^}7外,其余不同pH下,总体趋势是前4d生长较快,以后逐渐减缓,而在pH 6^}7内,日均生长速度较为稳定。
2. 3分离株长抱隔指抱菌生物学特性及形态观察
    长抱隔指抱菌在C'MA培养基上菌落生长慢,稀疏;营养菌妊无色、分枝、分隔,宽为1. 3一2. 5 Cl. 50) },m;分生抱子梗直立、较短、少有分枝、无色、分隔(图3-b),长65. 0一195.8(105.55)pm,基部宽2. 5 ^-3. 0 C2. 6 5) },m,顶端1. 2一2. 001.45) },m,简单或偶尔在顶端产生一小分枝;分生抱子无色、长纺锤形(图3-a),大小29. 0一67. 3C42) X 4. 0一6. 5 C4. 20) },m, 5一9个分隔,以7一8个分隔为主,成熟时可在抱子顶端形成1 ^- 2个钻性球(图3-c);分生抱子可以产生次生分生抱子梗,45. 0一105.0<88.25,n=5)},m长,基部宽2. 5一3.0 C2. 67, n=5) },m,顶部宽1. 0一1. 5 Cl. 2 5 ,n=5)  },m;次生抱子分隔3一8个,大小8. 0一31 .5(19. 10,n=5)只3. 5 ^} 4. 8(3. 88,n=5)pm;捕食器官为粘球(图3-a } 3-c)和非收缩环;线虫与真菌相互作用后,接触非收缩环后被环内的粘性物质粘住而捕食线虫(图4}),即使在没有线虫诱导的情况下也可自发性产生非收缩环(图4-b),非收缩环柄长9. 0一32. 5 C18. 85) X 1. 2一2. 0 Cl. 5) },m,环直径12.5^-22.5(17.65) }m,粘球柄2. 5 ^-3. 6 C2. 75) },m长、1. 5 Cl. 5) },m宽,粘球直径5. 0一6. 25 C5. 55) X 5. 5一6. 25 C 5. 55)pm。在PDA上培养,生长速度较快,培养第4天时菌落平均直径可达11. 67 mm,培养第15天平均直径达52. 25 mm,其菌落的形态因气生菌妊与低层菌妊交替呈现典型的同心圆状(图5)0
3讨论
3. 1本研究结果表明,长抱隔指抱菌在15一3 0 `C之间均能生长,其中以2 5 `C时生长最佳,其次为2 0 `C,在3 0 `C时生长不良。Morgan等川研究表明,l1. olinosp。二和D.  flanra。的最适生长温度不同,分别是20 ^-25 `C } 25 ^-30 `C,但在25^-28 `C捕食活性最高。Den Belde:等[‘门对n.olinosp。二的研究表明,线虫周围粘网的形成及其线虫体内同化菌妊的发育,在5 ^-10  `C下比15 ^-30 `C要慢得多。张克勤等[‘。〕测定5种粘网形成菌(包括l1. olinosp。二)生长和粘网形成与温度的关系,最适生长温度是2 8 `C,最适粘网形成温度是2 2 `C。本研究对长抱隔指抱菌的试验结果基本与上述报道的食线虫真菌生长温度相一致。由于本试验设计初期参考国内外已报道的资料,在此基础上根据地区环境设定试验温度范围,而结果显示设定的最高培养温度3 0 `C时仍能长,但生长受到明显抑制。在所设计的最低温度15 `C下生长较好,可能与该菌株分离于中国北方地区有关,估计15 `C以下仍能生长繁殖。这可能由于各地气候、地理位置不同,故不同生态位的菌株在生长温度上存在差异。
3. 2关于土壤和培养基pH对捕食线虫性真菌的影响,不同研究者的研究结果有差异。()lthof等[“〕认为节丛抱属的种类如l1.   oligosp。二、n.conoid。的最合适pH为5一6 , Bogus等[m〕认为节丛抱属生长pH范围与(()lthof等的研究结果相同;秦泽荣等[}:3〕和禹旺盛等[‘,〕曾对节丛抱属的一些捕食线虫真菌进行研究,认为在pH 5. 0一8. 0均能够生长,但pH 6. 0^}6. 5时,即弱酸性条件生长最佳。何胜洋等[ls〕认为基质pH的变化对虫生轮枝霉的产抱影响不大,在pH 5^}9时生长良好,但抱子萌发需要较为严格的pH,pH为7最好。本试验首次测定pH和温度对长抱隔指抱菌生长的影响,得出的结果是在碱性的环境下生长良好,这在以往的资料中未见到。然而,食线虫菌物在土壤中生长一段时间后,可使土壤的pH有所提高,它们的分布与土壤的pH有一定的联系,如具有钻性菌妊、菌网的种类在碱性的土壤中分布较多,而具有钻性球和环的种类在酸性土壤中的分布较多川。但相关性分析结果表明,土壤因子与捕食线虫菌物之间没有明显的相关性,在有机质含量较高的沙性土壤中,捕食线虫菌物密度较大,但与线虫总密度、土壤pH呈负相关[lj。一般来说,同一属菌的各个菌种对pH的要求尽管有所差异,但具有较大的一致性,而pH对捕食线虫菌物的影响以及它们的分布与土壤pH之间的关系有待于进一步研究。
3. 3捕食线虫性真菌分生抱子是由菌妊体发育到一定阶段后形成的,通常出现在菌妊生长后期。分生抱子位于分生抱子梗顶端或近顶端部,每个分生抱子梗上的分生抱子形态、数量和排列方式随捕食线虫性真菌种类不同而异。分生抱子的形态一般比较固定,所以捕食线虫性真菌的分类主要是以分生抱子为鉴定依据。本研究中的分离株分生抱子呈长纺锤形、5一9个分隔,在顶端形成1 ^- 2个钻性球,可产生次生分生抱子梗,捕食器官为粘球和非收缩环,这些特征与文献记载[},几〕的长抱隔指抱菌基本相一致,而该菌在PDA上形成的菌落呈现典型的同心圆状,以往的资料中尚未见到,笔者认为这也是其生长特征之一。